小鼠Ⅰ型膠(jiao)原C端肽(CTX-Ⅰ）elisa試劑盒簡介簡介

小鼠Ⅰ型(xing)膠(jiao)原C端肽(CTX-Ⅰ）elisa試劑盒實驗(yan)原理

小鼠Ⅰ型膠原C端肽(tai)(CTX-Ⅰ）ELISA試(shi)劑盒采用雙抗(kang)體一(yi)步夾心法酶聯免(mian)疫吸附試(shi)驗（ELISA）。往預先包被小(xiao)鼠Ⅰ型膠原C端(duan)肽(CTX-Ⅰ）捕(bu)獲抗(kang)體的(de)包被微(wei)孔中，依次(ci)加入標本、標準品(pin)(pin)、HRP標記的(de)檢(jian)測抗(kang)體，經(jing)過(guo)溫育并徹di洗滌(di)。用底物TMB顯(xian)色(se)(se)，TMB在(zai)過(guo)氧化物酶的(de)催化下轉化成(cheng)藍(lan)色(se)(se)，并在(zai)酸的(de)作用下轉化成(cheng)最(zui)終的(de)黃色(se)(se)。顏色(se)(se)的(de)深淺(qian)和樣品(pin)(pin)中的(de)小(xiao)鼠Ⅰ型膠原C端(duan)肽(CTX-Ⅰ）呈正相關。用酶標儀在(zai)450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品(pin)(pin)濃(nong)度。

樣(yang)本處理及要(yao)求(qiu)

1.  血清：將收集于血(xue)(xue)清分離管的全血(xue)(xue)標本在室(shi)溫放置(zhi)2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清(qing)即可，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避免(mian)反復凍(dong)融。
2.  血漿：用(yong)EDTA或肝素作為抗凝(ning)劑采(cai)(cai)集標本，并將標本在采(cai)(cai)集后的(de)30分鐘(zhong)(zhong)內于2-8℃ 1000×g離(li)心15分鐘(zhong)(zhong)，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應(ying)避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用(yong)預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)，去(qu)除殘留血液(ye)（勻漿(jiang)中裂解的(de)紅細(xi)胞會影響測量結(jie)果），稱重后將組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)剪碎(sui)(sui)(sui)。將剪碎(sui)(sui)(sui)的(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)與對(dui)應體(ti)積的(de)PBS（一般按1:9的(de)重量體(ti)積比(bi)，比(bi)如1g的(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)樣品對(dui)應9mL的(de)PBS，具體(ti)體(ti)積可根據實驗需(xu)要適當調整，并做好記錄(lu)。推薦在PBS中加入(ru)蛋白(bai)酶抑制劑）加入(ru)玻(bo)璃勻漿(jiang)器(qi)中，于冰上(shang)充分研磨(mo)。為了進一步(bu)裂解組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)細(xi)胞，可以對(dui)勻漿(jiang)液(ye)進行超(chao)聲破碎(sui)(sui)(sui)，或(huo)反復(fu)凍融。最(zui)后將勻漿(jiang)液(ye)于5000×g離心5~10分鐘(zhong)，取上(shang)清(qing)檢測。

4. 細(xi)胞培養(yang)物上清或其(qi)它生物標本：請1000×g離(li)心(xin)20分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清(qing)即(ji)可檢測，或將上(shang)清(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應避免(mian)反(fan)復凍融。

注：標本(ben)溶血(xue)會(hui)影(ying)響最后檢測結果，因此溶血(xue)標本(ben)不(bu)宜進行(xing)此項檢測。

需要而未提供的試劑盒器(qi)材

1.酶標儀（450nm）

2.高精度(du)加樣(yang)器(qi)及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸(zheng)餾水(shui)或(huo)去(qu)離子(zi)水(shui)

備注：

1、標準品濃度依次為：詳見(jian)說明書；

2、經過大(da)量正常標(biao)本檢驗(yan)(yan)，標(biao)本的(de)正常濃度值均(jun)在試劑盒提供的(de)檢測范圍內，實驗(yan)(yan)過程(cheng)中直接取(qu)50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

注(zhu)意事(shi)項

1、嚴格按照規定的(de)時間和溫度進行溫育以(yi)保證準(zhun)確結(jie)果。所(suo)有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即(ji)冷藏保存試劑(ji)。

2、洗板不(bu)(bu)正(zheng)確(que)可以導致(zhi)不(bu)(bu)準確(que)的結果。在加入底物前確(que)保盡量(liang)吸(xi)干(gan)孔內液(ye)體。溫育過程中不(bu)(bu)要讓(rang)微孔干(gan)燥掉。

3、消除板底(di)殘(can)留的液體(ti)和手指印，否(fou)則影響OD值(zhi)。

4、底(di)物顯色液(ye)應呈(cheng)無色或很淺的(de)(de)顏(yan)色，已經(jing)變藍的(de)(de)底(di)物液(ye)不能使用。

5、避免試劑和(he)標本的交(jiao)叉污染以免造成錯誤結果。

6、在儲存和溫育(yu)時避(bi)免強光直接照射。

7、平衡至室溫后(hou)再打開(kai)密封袋以防水(shui)滴凝聚在冷板條(tiao)上。

8、任何反應(ying)試劑(ji)(ji)不(bu)能(neng)接觸(chu)漂白(bai)溶(rong)(rong)劑(ji)(ji)或漂白(bai)溶(rong)(rong)劑(ji)(ji)所散發的強烈氣體。任何漂白(bai)成分都會破壞試劑(ji)(ji)盒中反應(ying)試劑(ji)(ji)的生物活性。

9、不能使(shi)用過期產品。

10、如果可能傳播(bo)疾病，所有的(de)樣品(pin)都應管(guan)理好，按(an)照規定的(de)程序(xu)處理樣品(pin)和檢測裝置。

試劑準備

試(shi)劑盒從冷(leng)藏(zang)環(huan)境中取出應在(zai)室(shi)溫(wen)平衡后(hou)方可使用。

20×洗滌緩沖液的(de)稀釋：蒸餾水按1：20稀(xi)釋，即1份20×洗滌緩(huan)沖液(ye)加19份蒸餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡(heng)20min后的鋁箔袋中取出所需板條(tiao)，剩余板條(tiao)用自封袋密封放回4℃。

2. 設置標準品孔(kong)和樣本孔(kong)，標準品孔(kong)各加不同濃度的(de)標準品50μL；

3.樣本孔中(zhong)加入待測樣本50μL；空白(bai)孔不加(jia)。

4. 除(chu)空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biao)記的檢(jian)測抗(kang)體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴(yu)鍋或恒溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5. 棄去液(ye)體，吸水紙上拍干，每孔加(jia)滿(man)洗滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩(shuai)去洗(xi)滌液(ye)，吸水紙上拍(pai)干，如此重復洗(xi)板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底(di)物A、B各50μL，37℃避(bi)光孵育15min。

7.每孔加入終止液(ye)50μL，15min內，在450nm波長(chang)處測定各孔的(de)OD值。

實驗結果計算(suan)

以所(suo)測標準品的OD值(zhi)為(wei)橫(heng)坐標(biao)(biao)(biao)，標(biao)(biao)(biao)準品的(de)濃度值(zhi)為(wei)縱坐標(biao)(biao)(biao)，在坐標(biao)(biao)(biao)紙上(shang)或用相關軟(ruan)件繪制標(biao)(biao)(biao)準曲(qu)線(xian)，并得到直(zhi)線(xian)回歸方程(cheng)，將樣品的(de)OD值代入(ru)方程，計(ji)算出樣(yang)品的濃度。

試(shi)劑(ji)盒(he)性能

1、檢測范(fan)圍：詳見產品說(shuo)明書。

2、靈敏度：詳情見說明書。

3、特異性：不與其它(ta)可溶(rong)性結構類似物交叉(cha)反應。

4、重復性：板內變異(yi)系數(shu)小于10% ，板間變異(yi)系數(shu)小于15% 。